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【Nanolive应用案例】使用细胞全息3D成像技术观察并评估赛乐西帕Selexipag对肺动脉平滑肌细胞PASMC的作用

2020-11-23

作者:Biotimestech-Geo


前列环素(PGI2)受体(IP受体)激动剂用于治疗肺动脉高压(PAH),可增加细胞内cAMP水平,从而抑制肺血管收缩、肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和细胞外基质合成。赛乐西帕Selexipag(Uptravi, 2-{4-[(5,6-diphenylpyrazin-2-yl)(isopropyl)amino]-butoxy}-N-(methylsulfonyl)acetamide)是第一种非前列烷类IP受体激动剂,可口服,最近被批准用于治疗PAH。在这项研究中,原文作者发现Selexipag的活性代谢物和临床疗效的主要贡献者ACT-333679(以前称为MRE-269)在多个PAH相关受体远端或下游细胞检测中表现为完全激动剂,其最大功效(Emax)可与原型PGI2类似物伊洛前列素相媲美。在PASMC中,ACT-333679可诱导细胞松弛(EC50 4.3nM),抑制细胞增殖(IC50 4.0nM)和细胞外基质合成(IC50 8.3nM)。相比之下,ACT-333679在受体近端或上游cAMP累积分析(Emax 56%)显示出部分激动剂,与伊洛前列素和前列腺素类似物beraprost和Treprotinil(Emax∼100%)相比。ACT-333679的部分激动剂也导致β-阻遏素招募受限(Emax 40%)和缺乏持续的IP受体内化,而在这些脱敏相关试验中,所有受试的PGI2类似物均表现为完全激动剂。与这些体外研究结果一致,赛乐西帕(而不是曲前列素)在大鼠肺动脉高压和全身性高血压模型中显示出持续有效性。因此,ACT-333679的部分激动剂允许在放大的受体远端PAH相关信息读出中发挥充分的功效,同时导致脱敏相关受体近端信息读出的活动受限。



Fig. 1.  赛乐西帕Selexipag及其活性代谢物ACT-333679的化学结构。母体药物Selexipag在体内酶水解为其活性代谢产物。



Fig. 2.  IP受体激动剂ACT-333679和伊洛前列素在人肺动脉平滑肌细胞受体远端肌球蛋白松弛信息读出中的功效和效力。(A) 激动剂刺激90分钟后MLCK磷酸化,α/β-微管蛋白染色作为上样内参。代表性试验n=2。(B) 两个实验的平均MLCK磷酸化/微管蛋白比率(±S.D.),通过对iloprost的最大响应(=100%)进行归一化。*P<0.01,显著高于载体,单侧学生t检验。(C,D)用ACT-333679或iloprost处理细胞,(C)记录阻抗变化(显示ACT-333679的原始痕迹)和(D)ACT-333679和iloprost的浓度-反应曲线在刺激后3小时内由阻抗最小值生成。数值代表技术复制的平均值±标准差。代表性试验n=3。(E) 肌球蛋白抑制剂blebbistatin处理细胞的原始痕迹。(F) 用ET-1(10 nM)处理细胞,2小时后用IP受体激动剂(ACT-333679显示阻抗原始迹线),并且(G)在IP受体激动剂添加1小时后根据阻抗值生成浓度-反应曲线。数值代表技术复制的平均值±标准差。代表性实验n=2。



Fig. 3.  IP受体激动剂ACT-333679对人PASMC细胞形态变化的影响(通过时间推移层析显微镜测定)。用ET-1(100nM)诱导细胞收缩。70–90分钟后,细胞要么用(A)ACT-333679(1μM)处理以诱导松弛或(B)载体。或者,(C)用载体对细胞进行两次处理。在整个实验期间(180分钟)定期拍摄断层图像,并沿时间进程显示一组图像,用虚线表示基线细胞周长。标识条:20μm。n=3个实验。图为其中一个代表性实验。相应的视频可访问以下链接:http://orbit.actelion.com/selexipag/



Fig. 4.  ACT-333679和iloprost对人PASMC受体远端增殖和纤维化相关信息读出的疗效和效力。在IP受体激动剂存在下,PDGF-BB处理24小时后血清饥饿细胞(A)p27(Kip1)和(B)细胞周期蛋白D1的免疫印迹。α/β-微管蛋白染色作为负荷对照。代表性实验n=2。(C) 在IP受体激动剂存在下,用PDGF-BB处理24小时的血清饥饿细胞的[3H]-胸腺嘧啶核苷掺入。数据为至少10个实验的平均抑制(±S.E.M.)。(D) 在IP受体激动剂存在下,用PDGF-BB处理40小时的血清饥饿细胞的[3H]-脯氨酸掺入。数据为3个实验的平均抑制(±S.E.M.)。



Fig. 5.  IP受体激动剂在利用人PASMC和表达高或低IP受体水平的细胞进行环腺苷酸累积分析中的功效和效力。(A) 激动剂刺激30分钟后PASMC的反应。数值代表技术复制的平均值±标准差。代表性试验n=3。(B) T-REx-HEK亲代和随着四环素浓度增加诱导的T-REx-HEK-hIP细胞中hIP受体的免疫印迹。(C) 在具有高(10 ng/ml四环素)或低(1ng/ml四环素)IP受体表达水平的T-REx-HEK-hIP中刺激30分钟后的反应。数值代表技术复制的平均值±标准差。代表性试验n=2。



TABLE 1在人源PASMC或T-REx-HEK-high-hIP和T-REx-HEK-low-hIP细胞中测定不同IP受体激动剂的平均EC50值和Emax值。
Emax,与伊洛前列素相比的最大疗效;σg,几何标准差;ND,未进行测定;S.D.,运算标准差。α For PASMC, EC50 values were derived using the individual curve-intrinsic maxima, and their geomean is shown. For Emax, arithmetic mean is shown; n = 3 measurements. β For HEK cells, EC50 values were derived using the individual curve–intrinsic maxima. Shown is the geometric mean with individual values in brackets. Emax: Shown are the arithmetic means, with individual values in brackets (n = 2 measurements).



Fig. 6.  IP受体激动剂诱导表达人源IP受体的CHO细胞β-arrestin募集的效能和效力。用IP受体激动剂处理PathHunter CHO-hIP细胞90分钟,加入β-半乳糖苷酶底物,测定其化学发光。数值代表技术复制品平均值(±标准差)。代表性实验n=6个。



TABLE 2β-arrestin募集法测定CHO-hIP细胞不同IP受体激动剂的EC50和Emax平均值(酶片段互补法)。EC50值通过个体曲线-内在最大值得出, Emax是与伊洛前列素相对的最大疗效;测量数量n=6。σg,几何标准差;S.D.,运算标准差。



Fig. 7.  IP受体激动剂内化重组人源IP受体的有效性和效力。CHO-hIP细胞与不同的IP受体激动剂共孵育20小时。细胞固定并染色(IP受体绿色,细胞核蓝色)。代表性试验n=2。



Fig. 8.所选IP受体激动剂内化重组人IP受体的有效性和效力。将HEK-T-REx-Flag-hIP细胞用稀释系列IP受体激动剂孵育指定时间,用抗Flag抗体染色表面IP受体并用流式细胞仪定量。数值代表两个独立实验的平均值±标准差。



Fig. 9.  5天以上重复口服selexipag对清醒MCT肺动脉高压大鼠MPAP的影响。selexipag(10mg/kg)每日(早晚)灌胃给药5天。MPAP是用植入遥测系统测量的。数据以平均值±标准差表示,n=7-8。



Fig. 10.静脉注射selexipag超过7天(A)、selexipag(B)和Treprotinil(C)超过48小时对清醒SHR MAP的影响。载体或试验化合物通过植入的微型渗透泵以静脉输液连续给药。在外科植入微型泵的过程中没有血流动力学记录,如数据收集所示(B和C)中断。每只动物在输注溶媒或试验化合物前48小时作为对照期。数据以平均值±标准差表示;selexipag,n=9;treprostinil,n=15。



TABLE 3  SHR连续静脉输注selexipag 7天时ACT-333679的血浆浓度。数据表示为平均值±标准差(n=3)。



TABLE 4  SHR连续静脉输注treprostinil曲前列环素48小时后的血浆浓度。数据表示为平均值±标准差(n=4)。



Fig. 11.示意图展现selexipag代谢物ACT-333679在IP受体处的部分激动如何避免受体脱敏,同时仍然保持受体远端抗PAH相关读数的有效性。IP受体信号级联中的受体近端事件,如cAMP积累、b-阻遏素募集和受体内化被ACT-333679激活,但其有效性有限(与完全有效的PGI2类似物相比存在部分激动),而由于信号放大受体远端事件,如抗收缩作用,ACT-333679可有效激活抗增殖和抗纤维化(完全激动)。

本文以题为 “Selexipag Active Metabolite ACT-333679 Displays Strong Anticontractile and Antiremodeling Effects but Low b-Arrestin Recruitment and Desensitization Potential” 于2017年7月发布在国际著名期刊THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS上。
论文链接:http://jpet.aspetjournals.org/content/362/1/186

文中的细胞成像部分使用了Nanolive细胞3D显微成像技术。Nanolive无标记3D成像又称活细胞显微CT,通过多角度衍射场断层扫描技术,3D Cell Explorer成功突破了光学衍射167nm的极限,极限可达到75nm横向分辨率,非常适合活细胞结构的纳米级观测,如各种细胞器。1994年,超分辨荧光显微技术(2014获得诺贝尔化学奖)首次突破光学衍射200nm极限,Nanolive是目前仅有的第二个突破167nm极限的光学成像技术,而且是唯一能实现非侵入、无标记活细胞纳米尺度成像的技术。此技术发表于Nature,Cotte Y. et al., Marker-free phase nanoscopy, Nature Photonics, 2013。3D Cell Explorer系列是一款探索的工具,与现有的任何技术并不冲突,由于3D Cell Exporer所揭示的现象为细胞最真实、最本质变化(3D Cell Exporer是目前唯一能在167nm尺度进行无标记活细胞3D细胞结构构建的技术),因此可以让科研工作者从全新角度去探索,有助于发现细胞生命新活动,并可结合传统实验手段进行更深入的研究,包括各种高端共聚焦、电镜、原子力、核磁、质谱等。



Nanolive有以下一些功能特点:


1.活细胞无标记成像方案


2.软件—3D图像获取构建与数字化染色软件



3.软件—细胞功能分析软件


(无标记亚细胞结构动态分析-线粒体+脂质体)


(无标记细胞骨架动态分析)



Nanolive实时无标记3D显微镜系列成像系统作为一个近年全新开发出的技术,已在一些领域有所应用,并在不断扩充中:

1.微生物侵染细胞观察与分析
2.细胞周期观察和分析
3.药物作用机理分析
4.酵母细胞分裂研究
5.3D细胞培养
6.细胞自噬研究
7.纳米材料开发研究
8.亚细胞器定位观察
9.GFP或RFP转染分析
10.无需染色的H&E及HF检测
11.植物学研究
12.细胞间相互作用分析
13.凋亡、死亡机制研究
14.分子共定位分析
15.CTC细胞无损伤鉴定
16.微囊泡追踪
17.环境生物学


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