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【Optiscan应用案例】利用探头式活体共聚焦成像系统活体小鼠微血管内红细胞运动轨迹示踪

2020-11-23

作者:Biotimestech-Geo



简介:微血管和相关的病理学要求动态成像。我们评估了一种新型的小型共焦激光扫描探针,用于在健康啮齿动物和疾病模型中的血管、血流、细胞追踪和灌注的活体可视化。

方法:手持共焦显微镜系统允许在动态变化的成像深度下放大500到2400倍。单独或联合使用不同的活体染色剂进行组织、细胞核、血浆和血管内皮细胞染色,进行血流显示,并对单个细胞群进行靶向染色。

结果:Optiscan探头式活体共聚焦成像系统可获得高分辨率的活体图像。连续切片观察脑微血管中白细胞与内皮细胞的相互作用。连续注射FITC标记的红细胞、FITC葡聚糖和吖啶后,发现微血栓形成。狼疮性肾炎MRL/lpr小鼠模型可见肾小球改变。

讨论:Optiscan探头式活体共聚焦成像系统的实时高分辨率亚表面成像,动态显示血管、细胞、血流和相关病理,允许在细胞水平上进行真正全面的血管成像。


具体方法:

Optiscan探头式活体共聚焦成像系统

Optiscan探头式活体共聚焦成像系统——FIVE-1(Optiscan,Melbourne,Vic.,Australia)使用488nm单线激光在活体内激发荧光团。在大于505nm处检测到荧光发射。用手持式探头(型号RBK6315A:末端直径5.0 mm,轴直径6.3 mm)拍摄475×475μm的图像,每个图像的横向分辨率<0.7μm,轴向分辨率(光学片厚度)为7.0μm。使用脚踏板动态改变成像深度;成像深度可以在组织表面以下0-250μm范围内以4μm的增量进行调整。组织表面的激光功率由用户控制在0到1000μW的范围内,以获得合适的图像对比度。在进行中的检查中没有对仪器进行重大调整。每次检测,使用脚踏板获取50-500个图像,数字存储为12位灰度图像。如前所述,再利用Image J 1.30v(W.Rasband,NIH,Bethesda,Md.,USA)从z轴堆栈执行三维重建


共聚焦成像与动物模型

健康雄性或雌性小鼠有C57BL/6或FVB背景。以2只MRL/lpr小鼠(4月龄和7月龄)为狼疮性肾炎模型,并与同龄对照组进行比较。对两只蒙古沙鼠进行三重染色。动物在美因茨大学的动物设施中,在温度控制的环境中,以12小时的明暗循环饲养,并定期喂饲颗粒状啮齿动物日常食物和随意饮水。动物程序符合机构标准。

对于活体共聚焦成像,使用12 ml/kg的avertin i.p.对动物进行深度麻醉(1 g 2,2,2-三溴乙醇/1 ml叔戊醇,德国西格玛-奥尔德里奇;2.5%磷酸盐缓冲盐水)。感兴趣的器官被手术暴露。在脑部成像中,头部被固定在立体定向框架内,并进行颅骨开窗,使硬脑膜保持完整。通过将共聚焦成像窗口放置在探针尖端,与感兴趣的器官直接、温和地接触,或者用手(相当于拿着笔)或将其安装在立体定向框架上(用于连续成像相同的视野(图3A-C)或三维重建(图1))来生成图像。通过观察组织的微观结构,在体内实时识别器官内的病理变化。所有的发现都是通过在连续的深度捕获相邻的成像平面序列来获得体积组织样本来记录的。活体成像后,动物被过量注射avertin处死,并在适当的情况下采集组织标本。


染色程序

在全身应用荧光剂后收集的共聚焦图像。这些药物通过尾静脉或心内给药给小鼠,通过静脉输注到左股静脉给沙鼠。

单荧光团实验

荧光素钠(Alcon Pharma,Freiburg,Germany)以100μg/g体重给药。FITC标记的右旋糖酐(MW 150 kDa,Sigma-Aldrich,Steinheim,德国)以250μg/g体重注射。盐酸吖啶(Sigma Pharmaceuticals,Melbourne,Vic.,Australia)以10μg/g体重施用。FITC标记的番茄凝集素(Vector,Burlingame,Calif.,USA)以15μg/g体重静脉注射。

血细胞标记

红细胞的荧光标记如前所述。简言之,处死沙鼠,取全血离心10min,除去血沉棕黄层和血浆,用葡萄糖-盐水缓冲液洗涤红细胞。红细胞与9mg FITC/ml血液孵育2小时,在缓冲液中洗涤5次。标记的红细胞用生理盐水和柠檬酸-磷酸葡萄糖稀释至45%的红细胞压积保存。然后,每10g体重注射15μl悬浮液。

为了标记小鼠淋巴细胞,如前所述,用MACS®柱(Miltenyi Biotech,德国BergischGladbach)采集脾脏单核细胞并分离;用10μg FITC标记的抗CD3单克隆抗体(clone 17A2,BD Biosciences Pharmingen,San Diego,Calif.,USA)孵育107的细胞。在4°C下避光1h,无需进一步固定,然后立即注入同基因小鼠(n=2只)。

从脾脏中分离小鼠外周血单个核细胞(PBMCs),用吖啶黄孵育并注入同基因小鼠(n=2只)。

双标记和三标记实验

对于双标记和三标记,优化了荧光团的浓度,以提供足够的背景对比度,以便在检测的同时仍允许对其他目标结构进行区分。为靶向成像选择了更强的对比度。分别以5μg/g和50μg/g静脉注射吖啶和荧光素,以提供低对比度背景染色。

在沙土鼠脑微血管的三重标记成像中,在左股静脉内放置一条静脉通道。标记的红细胞、FITC葡聚糖(MW 60 kDa,Sigma,滴定至10μg/g)和吖啶(10μg/g)按顺序注入,同时对脑组织成像,以监测每种造影剂的足够组织对比度。

结果


Fig. 1.脑微血管。(A) 注射FITC葡聚糖后小鼠脑毛细血管网络的可视化研究。以4μm的间隔对一系列连续的光学切片进行三维重建,并以斜角捕获。(动画重建作为在线支持提供。图1和图2,www.karger.com/doi/10.1159/000148242(B–E)沙土鼠的脑微血管。(B) 小动脉的结构。在用吖啶标记细胞核、FITC葡聚糖染色血浆和注射标记红细胞后,显示不同深度的高分辨率光学切片(C–E)。小动脉的特点是平滑肌细胞的横带导致血管壁的微小收缩。圆形平滑肌细胞(箭头)的细胞核与细动脉内腔内皮细胞(箭头)的细胞核明显不同。血管壁上的白点(见E部分)对应于穿过圆形平滑肌细胞核的横截面,这些平滑肌细胞核呈圆周方向,内皮细胞核平行于血管轴。注意标记的小静脉中缺少肌肉细胞(*)。比例尺=100μm。



Fig. 2.微血管单染、双染和三染。(A) 注射FITC葡聚糖后,小鼠肠系膜中的单个毛细血管被选择性地突出。未染色的血细胞是未标记的,在管腔内呈黑色(箭头),允许对血流进行半定量评估。(B) 单个FITC标记的红细胞与沙土鼠脑血管中未染色的背景形成强烈对比(箭头)。(C) 低浓度FITC葡聚糖血浆复染与FITC标记红细胞联合应用时,未染色红细胞呈阴性(黑色)对比,而染色红细胞仍清晰可见(箭头),并与背景血浆标记对比。(D) 沙土鼠脑小静脉三重染色后血栓形成。静脉注射吖啶标记血管内皮细胞核和圆形平滑肌细胞核可以识别小动脉和小静脉。用FITC-葡聚糖标记的血浆(如中心的小动脉)灌注正常的未闭血管。含有微血栓形成的小静脉(箭头)的特征是血瘀(排除标记的血浆流)和含有捕获标记红细胞(箭头)的暗未标记红细胞的腔内团。血栓形成物质延伸到上游毛细血管。比例尺=100μm。



Fig. 3.血细胞追踪。(A-C)连续注射吖啶、FITC-葡聚糖和FITC标记的红细胞后,在脑血管内观察白细胞-内皮相互作用。在血管壁上有两个吖啶标记的单核细胞,呈淡白色,核内颗粒明显(箭头所示)。标记的血浆从两侧流过,表明与内皮细胞的相互作用很弱。然后,18秒(B)和20秒(C)后,由于细胞-内皮相互作用,血浆和红细胞流量(FITC标记红细胞,箭头)被限制在血管内的一侧。(D,E)用吖啶标记的PBMCs(箭头)可选择性地在肾毛细血管中(也可参见图4A,B)见到微弱的荧光素组织染色(D),而用荧光素静脉单染肾实质后,这种特定信号消失,毛细血管在肾小管周围呈黑色衬里。(F) 单个淋巴细胞(箭头)用FITC标记的抗CD3标记,并在吖啶染色的肝脏中可见。比例尺=100μm。



Fig. 4. (A) 在健康小鼠肾脏中,FITC-葡聚糖标记血浆后,肾小管密集排列,管周毛细血管清晰可见,部分排出至肾小管管腔(箭头)。(B) 将血管壁与L.esculentum凝集素进行选择性对比后得到类似的信息。(C) 在用吖啶染色后,染色明亮的细胞核线密集地排列着小管,与脑显像相反,吖啶很容易从微血管扩散到周围的组织中。(D) 血管环完全充满肾小球(箭头)。相比之下,7个月大的MRL/lpr小鼠的肾小球肾炎表现为肾小球血管环增大和水肿。(E) 鲍曼囊明显增厚(箭头所示),小管细胞核模糊。(F) 体外HE染色显示鲍曼囊肿胀。血管环水肿只能通过环从肾小球边界的回缩来推测,可能是由于固定人为现象引起的(箭头)。比例尺=100μm。


结果讨论

全组织的快速成像技术——Optiscan探头式活体共聚焦成像系统,允许在临床和基础科学中进行大量的显微镜和细胞分析。相比较而言,传统的台式共聚焦显微镜在动物疾病模型中显示血管、血流和细胞相互作用受到限制,因为需要使动物组织与显微镜的固定和笨重光学系统精确和稳定地对准。因此,很少有研究成功地将共聚焦显微镜应用于活体动物。大多数研究使用的组织标本或切片可能不足以监测动态事件,而体外微结构变化已被证明在组织制备后发生得非常迅速。

对于本研究中的活体血管成像,我们评估了一种新型探针,这种探针可以在活体内进行手持高分辨率活体共聚焦成像。利用这项技术,可以在不同的穿透深度下进行亚表面成像,并在活体内清晰地分辨出核形态等细微细节。差异荧光染色法允许在高分辨率下同时呈现体内正常血管、血流和细胞相互作用的不同特征。不同的吖啶扩散模式提示血管功能的体内分解:由于完整的血脑屏障,它明显局限于标记脑内的血管壁,而从肾的微血管漏出的扩散导致完全的实质染色。在狼疮性肾炎的小鼠模型中诊断出诸如脑小静脉血栓形成和(周围)血管改变等病理学改变。可能阻碍这种体外成像的固定人工制品在这种活体内成像方式中不起作用。尽管这一成像需要对被调查的器官进行有创性的检查,但感兴趣的组织本身的完整性得以维持。因此,在自然环境中连续成像单个细胞在连续切片中具有高分辨率是可行的。在类似的方法中,FITC标记的右旋糖酐外渗在体内的可视化显示增强了炎症和恶性组织中的血管渗漏,并在体内描述了肝组织热消融后的灌注异常。在目前的实验中,这种血浆流动的可视化与核标记和特定细胞类型的靶向染色相结合。使用单通道仪器对所有不同的污渍进行多重标记,激发波长和检测波长相同。虽然这种方法不允许在不同波长下进行共定位实验,但通过优化单个荧光化合物的浓度(必要时在直接显微镜监测下的检查期间重新注射)在体内提供了令人信服的形态学和功能数据。标记的靶结构在形态学上和所用造影剂的相对荧光强度上可以很容易地区分。最近,这种扫描系统被集成到一个灵活的结肠镜中,允许在活体内对人类胃肠道进行高分辨率显微镜检查。因此,具有微型探针的共聚焦显微镜在动物和人类血管研究的自然环境中的动态过程的活体成像方面具有巨大的潜力。

总之,新型共聚焦显微镜探针首次同时实现了高分辨率次表层成像和时间轴记录的结合,用于血管、细胞、血流和相关病理的动态活体可视化。这使得一个真正全面的血管成像成为可能,对深入了解血管微结构、细胞功能和体内相互作用具有巨大潜力。

本文以题为“Dynamic in vivo Imaging of Microvasculature and Perfusion by Miniaturized Confocal Laser Microscopy” 发布在国际著名期刊European Surgical Research上。论文链接:https://www.karger.com/Article/Abstract/148242

本文介绍了Optiscan探头式活体共聚焦成像系统——FIVE 2,该设备拥有可靠的性能以及出色的图像质量,在实时活体观察的基础了实现了设备的小型化、灵活性,并且不需要额外的专门技术人员和设备。





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